賽默飛2720PCR儀反應過程與細胞內的DNA復制相似，但PCR的反應體系要簡單的多，主要包括DNA靶序列、引物、4種單核苷酸dNTP、耐熱DNA聚合酶以及合適的緩沖液體系。

 

　　樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為zui大，這樣可以獲得準確，可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。

 

　　在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統，得出量化的實時結果輸出。

 

　　賽默飛2720PCR儀擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散是怎么回事？

 

　　1、降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

 

　　2、酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

 

　　3、若為PCR試劑盒則可能：①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

 

　　4、退火溫度過低。

 

　　5、引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

 

　　6、循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。

 

　　7、MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。

 

　　8、模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

 

　　9、電泳體系有問題：①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；②凝膠沒有凝固好；③瓊脂糖質量差。

 

　　10、dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。