SDS-PAGE（十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳）是分離蛋白質(zhì)混合物的核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)。以下是詳細(xì)的操作步驟、原理和關(guān)鍵注意事項(xiàng)，便于您理解和操作。

一、SDS-PAGE基本原理

1、變性： SDS使蛋白質(zhì)變性，破壞其二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，并將大量負(fù)電荷均勻覆蓋在肽鏈上，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差異。

2、電荷一致： 所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物均帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極遷移。

3、分子篩效應(yīng)： 聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)不同大小的蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同阻力。分子量越小，遷移越快。

因此，SDS-PAGE中蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于其分子量。

二、主要實(shí)驗(yàn)步驟

整個(gè)過(guò)程可分為制膠、樣品準(zhǔn)備、上樣與電泳、染色與分析四個(gè)階段。

A、制膠（以不連續(xù)系統(tǒng)為例）

不連續(xù)系統(tǒng)包含濃縮膠和分離膠，可提高分辨率和條帶銳度。

1、安裝制膠模具

清洗玻璃板并晾干，將其固定于制膠架上，確保底部密封。

2、配制分離膠（下層膠，決定分辨率）

選擇合適濃度： 根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量范圍選擇凝膠濃度（通常8%-15%）。

（1）小分子蛋白（<30 kDa）→ 高濃度膠（12-15%）

（2）大分子蛋白（>100 kDa）→ 低濃度膠（8-10%）

（3）混合范圍（10-200 kDa）→ 常用12%

3、按配方混合： 依次加入水、30%丙烯酰胺混合液、分離膠緩沖液（如Tris-HCl， pH 8.8）、10% SDS、10%過(guò)硫酸銨（APS）和TEMED。TEMED催化聚合，應(yīng)最后加入并立即混勻。

4、灌膠： 迅速將混合液注入玻璃板間隙至約2/3高度。

5、覆蓋液層： 輕輕加入異丙醇或水封層，壓平膠面并隔絕空氣，室溫垂直放置約30分鐘聚合。

6、配制濃縮膠（上層膠，使樣品濃縮成一條線）

（1）棄去封層液，用濾紙吸干。

（2）按配方混合： 混合水、30%丙烯酰胺混合液、濃縮膠緩沖液（如Tris-HCl， pH 6.8）、10% SDS、10% APS和TEMED。

（3）灌膠與插梳： 將混合液加在分離膠上，立即插入樣品梳，避免氣泡。室溫聚合約20-30分鐘。

B、樣品準(zhǔn)備

1、蛋白質(zhì)樣品： 與5× SDS上樣緩沖液混合（終濃度為1×）。

上樣緩沖液成分： SDS、DTT或β-巰基乙醇（還原劑，打斷二硫鍵）、甘油（增加密度）、溴酚藍(lán)（指示劑）、Tris-HCl（緩沖液）。

2、變性： 將混合后的樣品在95-100℃ 加熱5-10分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性和還原。

3、短暫離心： 加熱后短暫離心，收集管壁冷凝液。

C、上樣與電泳

1、安裝電泳槽： 將凝固的凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加入1× 電泳緩沖液（含Tris、甘氨酸、SDS）。內(nèi)外槽均需加滿緩沖液。

2、拔梳與上樣：

（1）輕輕垂直拔出樣品梳。

（2）使用微量上樣器，將準(zhǔn)備好的蛋白樣品和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Marker） 依次加入加樣孔。

（3）關(guān)鍵： 記錄上樣順序，Marker孔。

3、連接電源與電泳：

（1）正確連接電極（黑對(duì)黑，紅對(duì)紅，負(fù)極在上）。

（2）恒壓電泳： 推薦先以80-90V電壓電泳，待溴酚藍(lán)指示線進(jìn)入分離膠后（約30分鐘），將電壓提高至120-150V繼續(xù)電泳。

（3）終點(diǎn)判斷： 當(dāng)溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠底部約0.5-1 cm時(shí)，關(guān)閉電源。

D、染色與分析

1、取膠： 拆卸裝置，小心撬開玻璃板，取出凝膠。

2、固定與染色（以考馬斯亮藍(lán)R-250快速染色為例）：

（1）固定： 將凝膠放入固定液（如甲醇:乙酸=5:1）中搖動(dòng)15分鐘。

（2）染色： 轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖動(dòng)30分鐘至數(shù)小時(shí)。

（3）脫色： 移入脫色液（甲醇、乙酸、水混合物）中搖動(dòng)，期間更換脫色液數(shù)次，直至背景透明、條帶清晰。

（4）成像與分析： 用凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)Marker條帶的位置，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并估算目標(biāo)蛋白的分子量。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與常見問(wèn)題

1、安全重要性：

丙烯酰胺單體具有神經(jīng)毒性，操作液態(tài)丙烯酰胺或粉末時(shí)必須戴手套，在通風(fēng)處配制。

電泳時(shí)勿觸摸電極，防止觸電。

2、制膠關(guān)鍵：

分離膠和濃縮膠的pH不同，是形成不連續(xù)系統(tǒng)的關(guān)鍵，切勿混淆。

APS和TEMED是催化劑，應(yīng)分裝保存于4℃或-20℃，避免失效。

灌膠后若聚合過(guò)快或不聚合，檢查APS/TEMED的活性和用量。

3、電泳關(guān)鍵：

確保電泳緩沖液新鮮，且內(nèi)外槽緩沖液連通（對(duì)于垂直板電泳槽）。

初始電壓不宜過(guò)高，否則會(huì)導(dǎo)致條帶扭曲（“微笑"效應(yīng)）。

4、結(jié)果不佳的常見原因：

條帶彌散/拖尾： 蛋白質(zhì)降解或上樣量過(guò)大。

條帶彎曲/歪斜： 凝膠聚合不均、上樣速度過(guò)快產(chǎn)生氣泡、電泳溫度過(guò)高。

分子量估算不準(zhǔn)： 蛋白質(zhì)糖基化、磷酸化等修飾會(huì)影響遷移；非還原條件也會(huì)影響。

無(wú)條帶或信號(hào)弱： 蛋白濃度過(guò)低、轉(zhuǎn)膜/染色失敗、抗體失效（對(duì)于Western Blot）。