蛋白質SDS-PAGE電泳是分子生物學實驗室最核心的技術之一，其成功與否直接影響后續分析（如Western Blot）的結果。以下是一份詳盡的注意事項清單，涵蓋了從樣品準備到凝膠染色的全流程，以及常見問題排查。

一、實驗前的核心原則

1、還原與變性：確保蛋白質變性并打開二硫鍵，這是SDS-PAGE成功的基礎。使用含SDS（變性劑）和β-巰基乙醇或DTT（還原劑）的loading buffer，并充分煮沸（通常95-100℃，5-10分鐘）。

2、負電荷均一化：SDS與蛋白質結合（每克蛋白質結合約1.4g SDS），使其帶上均勻的負電荷，從而讓遷移率主要取決于分子量。

3、安全重要性：丙烯酰胺單體是神經毒物，操作時應戴手套，并在通風櫥/操作臺內配制。實驗后洗手。

二、實驗流程分步注意事項

A、樣品制備階段

1、蛋白濃度測定：準確測定蛋白濃度至關重要。上樣量過高會導致條帶過寬、拖尾、甚至堵塞凝膠；過低則條帶信號弱。建議進行預實驗確定良好上樣量（通常10-100 µg/泳道，細胞裂解液約20-40 µg）。

2、Loading Buffer：

使用新鮮的還原劑（DTT/β-巰基乙醇），因其易被氧化失效。

煮沸后需短暫離心（~10秒），將管內壁冷凝水離心下來，避免上樣體積不準確。

煮沸后的樣品可立即上樣，或-20℃/-80℃保存。長期凍存的樣品在上樣前建議再次煮沸離心。

3、對照品：

預染蛋白Marker：用于實時監控電泳進程和估算分子量。

內參蛋白（如β-actin、GAPDH）：用于評估上樣均一性和實驗穩定性。

B、凝膠配制階段

1、清洗制膠器具：玻璃板、梳子、間隔條需洗凈并晾干或用ddH?O潤洗，防止凝膠中出現雜質或產生氣泡。

2、充分混勻：加入TEMED（催化劑）后，需立即充分混勻灌膠，因為聚合反應迅速開始。

3、避免氣泡：

沿玻璃板一角或使用移液器穩定注入分離膠溶液。

灌膠后，立即在上面輕輕加一層水封（異丙醇或ddH?O），壓平膠面并隔絕氧氣（氧氣會抑制聚合）。

4、聚合時間：室溫（約30分鐘）聚合一致。倒掉水封層后，用濾紙邊緣吸干殘留液體，但切勿觸碰膠面。

5、濃縮膠與加樣孔：

灌入濃縮膠后，立即平穩插入梳子，避免產生氣泡。

確保梳子水平插入，保證上樣孔深度一致，否則上樣時樣品會溢出。

C、上樣與電泳階段

1、電泳緩沖液：使用1× SDS-PAGE Running Buffer（Tris-Glycine-SDS）。內槽（上下槽）緩沖液不要混用，因為上槽緩沖液在電泳過程中pH會發生變化。建議不要重復使用緩沖液。

2、拔梳子：垂直向上平穩拔出梳子，避免撕裂加樣孔。拔完后，用注射器或移液器吸取電泳緩沖液輕柔沖洗加樣孔，去除未聚合的丙烯酰胺和碎片。

3、上樣技巧：

將樣品吸至加樣孔底部，緩慢推出，避免樣品飄出孔外或沖散鄰孔樣品。

4、留出空泳道：在兩側或樣品間上樣1× loading buffer作為空白對照，防止邊緣效應導致樣品條帶彎曲。

5、電泳參數：

濃縮階段（積層）：使用低電壓（如80V），使樣品在濃縮膠中被壓縮成一條窄線。此階段溴酚藍（指示劑）條帶會被壓扁。

6、分離階段：進入分離膠后，調高電壓（如120-150V）。電壓過高可能導致條帶彎曲（“微笑"效應）或發熱過度；過低則耗時長，條帶可能擴散。

7、監控：觀察預染Marker的分離情況和溴酚藍的位置。當溴酚藍遷移至凝膠底部約0.5-1 cm時，即可停止電泳。

D、染色與脫色階段

1、剝離凝膠：小心撬開玻璃板，根據Marker指示切下目標區域凝膠。操作時戴手套，防止污染和燙傷（如果使用熱敏染色法）。

2、染色方法選擇：

考馬斯亮藍染色：快速、經濟，靈敏度較低（~100 ng）。

銀染：靈敏度高（~1 ng），但步驟繁瑣，背景控制要求高。

熒光染色（如SYPRO Ruby）：靈敏度介于兩者之間，兼容質譜分析，無甲醇毒性。

3、關鍵點：

固定：染色前通常需要用甲醇/乙酸溶液固定蛋白質，防止其在后續步驟中擴散。

脫色：考馬斯亮藍染色后，需用脫色液（甲醇+乙酸+水）反復漂洗至背景干凈、條帶清晰。

保存：脫色后的凝膠可拍照，并保存在4℃的ddH?O或7%乙酸溶液中。

三、黃金法則總結

1、制膠要均，上樣要準，電泳要穩。

2、保持試劑新鮮，尤其是APS、TEMED和還原劑。

3、時刻注意溫度控制：樣品制備在冰上，電泳過程防止過熱。

4、做好對照實驗：Marker、陽性對照、陰性對照、內參對照缺一不可。

5、耐心細致：SDS-PAGE是基礎但精細的技術，每一步的微小失誤都可能影響最終結果。

遵循以上注意事項，將能極大提高SDS-PAGE實驗的重現性和成功率，為后續的蛋白功能研究打下堅實基礎。