伯樂（Bio-Rad）CFX Opus Deepwell實時熒光定量PCR儀的操作方法。這是一套標(biāo)準(zhǔn)、通用的操作流程，適用于大多數(shù)實驗。請務(wù)必始終參考您實驗室的具體SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作程序）和試劑盒說明書，因為不同實驗的細(xì)節(jié)可能有所不同。

一、CFX Opus DeepWell實時熒光定量PCR儀操作步驟詳解

整個操作流程可以概括為以下四個主要階段，CFX Maestro軟件也基本按照這個邏輯引導(dǎo)用戶：

1、創(chuàng)建實驗方案

（1）在CFX Maestro主界面，點擊 “新建實驗" 或 “創(chuàng)建新實驗"。

（2）設(shè)定實驗類型： 選擇“定量PCR"。

（3）編輯實驗方案：

反應(yīng)體積： 輸入您的反應(yīng)體系總體積（例如 20 µL）。

孵育溫度：

預(yù)變性： 通常為95°C，持續(xù)30秒到3分鐘（根據(jù)預(yù)混液說明書推薦）。

PCR循環(huán)（擴(kuò)增）：

變性： 通常是95°C，持續(xù)10-15秒。

退火/延伸： 通常是60°C，持續(xù)30-60秒。在此步驟收集熒光信號。循環(huán)次數(shù)通常設(shè)為40-45個循環(huán)。

熔解曲線（可選）： 如果您的實驗需要（例如使用SYBR Green染料），勾選此選項。儀器會在PCR結(jié)束后自動運(yùn)行熔解曲線程序，通常從65°C緩慢升溫到95°C，并持續(xù)監(jiān)測熒光變化。

（4）選擇熒光染料/探針：

點擊“檢測"或“通道"設(shè)置。

根據(jù)您使用的熒光物質(zhì)，選擇相應(yīng)的檢測通道（例如，F(xiàn)AM, HEX/VIC, ROX, Cy5等）。ROX通常被用作參考染料，用于校正孔間誤差。

為每個通道指定其檢測的目標(biāo)基因。

（5）保存此方案，可以為其命名以便后續(xù)調(diào)用。

2、第二步：設(shè)置板布局

（1）軟件會顯示一個虛擬的96孔板界面。

（2）分配樣品和目標(biāo)：

用鼠標(biāo)選中孔或一個區(qū)域，然后在右側(cè)面板進(jìn)行設(shè)置。

樣品類型： 為每個孔選擇“未知"、“標(biāo)準(zhǔn)品"、“陽性對照"或“陰性對照"。

目標(biāo)： 從下拉菜單中選擇該孔檢測的基因名稱（對應(yīng)之前設(shè)置的熒光通道）。

樣品名稱： 輸入有意義的名稱以便識別（例如，“Patient_1"， “Std_1e6"）。

對于標(biāo)準(zhǔn)品，您需要輸入準(zhǔn)確的初始模板濃度（例如，1,000,000 copies/µL），軟件將根據(jù)這些點自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）完成所有孔的設(shè)置后，板布局會以顏色和文字清晰顯示。

3、第三步：運(yùn)行前準(zhǔn)備與上樣

（1）準(zhǔn)備反應(yīng)體系：

在超凈工作臺或冰上，按照您的實驗方案配制qPCR反應(yīng)混合液。通常是將預(yù)混液、引物/探針、水和模板DNA/cDNA混合。

重要： 避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會干擾光路和熒光信號。

將配制好的反應(yīng)液分裝到qPCR反應(yīng)板的各個孔中。

（2）封板：

使用光學(xué)封板膜覆蓋板面。確保封板膜平整、緊密地貼在板子上，沒有褶皺和氣泡。這是防止蒸發(fā)和污染的關(guān)鍵步驟。

（3）上樣：

輕輕將反應(yīng)板放入CFX Opus儀器的樣品槽中。

注意方向： 確保板的A1孔位于儀器的左前方（通常有角標(biāo)或圖示指示）。

關(guān)閉儀器門，聽到鎖扣聲確保關(guān)緊。

4、第四步：啟動運(yùn)行

回到CFX Maestro軟件界面，檢查所有設(shè)置無誤。

點擊 “開始運(yùn)行" 按鈕。

軟件會彈出一個最終確認(rèn)對話框，顯示預(yù)計運(yùn)行時間。確認(rèn)后，點擊“開始"。

儀器將開始運(yùn)行您設(shè)定的溫控程序，并實時采集熒光數(shù)據(jù)。您可以在軟件界面上實時查看擴(kuò)增曲線和熒光信號的變化。

二、CFX Opus DeepWell實時熒光定量PCR儀運(yùn)行后數(shù)據(jù)分析

1、查看結(jié)果：

（1）擴(kuò)增曲線圖： 查看所有孔的擴(kuò)增曲線是否正常（S型曲線），陰性對照有無擴(kuò)增。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線： 如果設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)品，軟件會自動給出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并顯示其斜率、效率和R2值。理想的斜率在-3.3左右，效率接近100%，R2 > 0.99。

（3）Ct值： 軟件會為每個孔計算Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）。

（4）熔解曲線（如果運(yùn)行了）： 查看熔解峰是否單一，以確認(rèn)SYBR Green實驗的特異性。

2、數(shù)據(jù)導(dǎo)出：

您可以將Ct值、濃度結(jié)果、擴(kuò)增曲線圖等導(dǎo)出為Excel或PDF格式，用于進(jìn)一步處理和報告撰寫。

三、重要注意事項

1、安全重要性： 在清潔或發(fā)生泄漏時，請務(wù)必關(guān)閉儀器電源并拔掉插頭。

2、防污染： 始終使用帶濾芯的吸頭，并在專門區(qū)域配制反應(yīng)體系，以防止氣溶膠污染。

3、規(guī)范操作： 操作光學(xué)封板膜和反應(yīng)板時，請佩戴手套，避免用手直接接觸表面，以免影響光學(xué)讀數(shù)。

4、儀器維護(hù)： 定期根據(jù)手冊對儀器進(jìn)行清潔和維護(hù)。如果樣品發(fā)生泄漏，必須立即清潔樣品槽。

5、尋求幫助： 如果遇到任何儀器報警或異常結(jié)果，請首先參考用戶手冊，或聯(lián)系伯樂的技術(shù)支持。