關于賽默飛（Thermo Fisher）7500實時熒光定量PCR系統常用的染料，我們可以分為兩大類：DNA結合染料 和水解探針。以下是詳細的介紹和選擇指南：

一、賽默飛7500實時熒光定量PCR儀DNA結合染料

這類染料可以嵌入任何雙鏈DNA分子的溝槽中，一旦與DNA結合，就會發出強烈的熒光信號。其特點是“通用性強"、“成本低"、“實驗設計簡單"。

1、SYBR Green I

工作原理： 在PCR反應體系中免費加入SYBR Green I染料。它會特異性地嵌入新合成的雙鏈DNA中。每擴增一條DNA分子，就結合一個染料分子，熒光信號隨之增強，從而實現定量。

優點：

經濟實惠： 成本遠低于探針法。

使用方便： 無需設計復雜的探針，只需設計引物即可。

通用性強： 適用于任何基因的qPCR檢測。

缺點：

特異性較低： 它會與任何雙鏈DNA結合，包括引物二聚體和非特異性擴增產物，可能導致假陽性信號，影響定量的準確性。

不能進行多重PCR： 通常只能使用一個熒光通道，無法在同一反應管內檢測多個靶標。

在7500上的應用： SYBR Green I的熒光信號通常被配置在FAM通道（常用的通道）進行檢測。賽默飛的PowerUp SYBR Green Master Mix是其經典配套試劑。

2、TaqMan 探針

工作原理：

探針完整時，報告基團的熒光被淬滅基團吸收，檢測不到熒光。

在PCR擴增過程中，Taq酶發揮5‘ → 3’ 外切酶活性，將探針水解。

報告基團與淬滅基團分離，報告基團發出熒光。

優點：

特異性高： 需要引物和探針三者同時與模板結合才能產生信號，極大地減少了非特異性擴增帶來的干擾。

可進行多重檢測： 可以對不同的靶基因設計不同的探針，標記上不同顏色的報告熒光基團（如FAM, VIC, NED, ROX等），在同一反應管內同時檢測多個靶標。

缺點：

成本高昂： 探針的合成費用較高。

設計復雜： 對探針的設計和優化要求較高。

在7500上的應用： 這是7500系統的強項。7500系統配備了多個熒光濾光片，可以同時檢測多種染料。常用的TaqMan探針染料組合包括：

FAM - 常用，藍色通道。

VIC / JOE / HEX - 綠色通道，常用于內參基因。

NED / TAMRA / Cy3 - 黃色通道。

ROX - 通常作為被動參照染料，用于校正孔間誤差，不用于基因檢測。

二、如何選擇？

1、選擇SYBR Green I（染料法）當：

預算有限，需要進行大量篩查實驗。

檢測的靶基因數量不多，且已擁有特異性很好的引物。

只是初步定性或相對定量，對定量的精準度要求不是苛刻。

需要快速建立實驗方法。

2、選擇TaqMan 探針（探針法）當：

對結果的特異性和準確性要求高（如病毒載量檢測、基因分型、等位基因鑒別）。

需要進行多重PCR（如在同一個反應中同時檢測目標基因和內參基因）。

實驗背景復雜，可能存在非特異性擴增。

已有成熟的、經過驗證的探針和引物序列。

無論使用哪種染料，在進行正式實驗前，都必須進行方法學驗證，包括引物/探針的特異性驗證、擴增效率的測定以及標準曲線的建立。對于SYBR Green I法，實驗結束后必須進行熔解曲線分析，以確認擴增產物是單一的特異性條帶，而沒有引物二聚體等非特異性產物。