賽默飛StepOne實時熒光定量PCR儀的操作使用方法的詳細指南。內容涵蓋了從實驗準備到數據分析的完整流程，并強調了關鍵注意事項。

一、賽默飛StepOne實時熒光定量PCR實驗準備

1、儀器與試劑準備

儀器：確保StepOne PCR儀電源穩定，電腦已連接并安裝了StepOne Software。

耗材：選擇兼容的PCR反應板或八聯管（如Applied Biosystems™ MicroAmp™系列）和光學蓋膜。

試劑：準備好您的qPCR預混液、引物/探針、模板DNA/cDNA和無核酸酶水。

2、反應體系配制（在試劑準備區進行）

總體積：通常為20μL或10μL。

建議：配制一個主混合液，然后分裝到各反應孔，最后加入模板，以減少加樣誤差和污染。

對照設置：

無模板對照：用水代替模板，用于檢測試劑污染。

陽性對照：使用已知濃度的標準品，用于驗證實驗有效性。

3、上樣與封膜

將配制好的反應體系小心加入到反應板或八聯管中，避免產生氣泡。

使用光學透明蓋膜密封反應板。確保蓋膜緊密貼合，無褶皺，防止蒸發和交叉污染。

二、賽默飛StepOne實時熒光定量PCR上機運行

1、啟動軟件與放置樣品

打開電腦，啟動 StepOne Software。

打開StepOne PCR儀艙門，將密封好的反應板放入儀器樣品槽中，確保板子放置方向正確（A1孔在左上角）。

關閉艙門。

2、創建新實驗

在軟件主界面，點擊 "New Experiment"（新建實驗）。

3、設置實驗類型

在 "Setup" 選項卡下，選擇實驗類型：

Quantitation (Standard Curve)：定量，需要運行標準品來制作標準曲線。

Comparative Ct (ΔΔCt)：相對定量，常用，用于分析基因的表達差異。

Melt Curve：熔解曲線，通常在SYBR Green實驗后運行，用于檢查擴增產物的特異性。

Allelic Discrimination：基因分型。

4、編輯樣品孔布局

點擊 "Plate" 選項卡。

在虛擬的反應板界面上，用鼠標選擇孔位，然后右鍵或使用左側工具欄定義其屬性：

樣品類型：未知、陽性對照、陰性對照、標準品。

樣品名稱：如"Sample 1"，"Control"等。

目標基因：為每個孔指定檢測的基因（如GAPDH， Target Gene）。軟件允許在同一塊板上進行多基因檢測。

重復：設置技術重復。

5、運行實驗

檢查所有設置無誤后，點擊軟件右上角的 "Start Run"（開始運行）按鈕。

輸入實驗名稱和保存路徑。

儀器將開始運行，您可以在軟件界面上實時查看擴增曲線和溫度狀態。

三、日常維護

1、清潔：定期用70%乙醇和無塵紙清潔樣品槽表面。

2、校準：根據儀器提示或定期進行光學校準。

3、記錄：記錄每次使用情況和任何異常。