賽默飛QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的正確操作使用方法指南。它將分為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、上機(jī)操作、運(yùn)行監(jiān)控和后續(xù)處理幾個(gè)部分，并包含重要的注意事項(xiàng)。

一、賽默飛QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR重要部分：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、儀器準(zhǔn)備：

（1）開啟電腦和QuantStudio 5儀器電源，等待系統(tǒng)啟動完成。

（2）打開 QuantStudio Design and Analysis 軟件。

（3）檢查儀器狀態(tài)，確保無錯誤報(bào)警。

2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

在軟件中或紙上規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)布局，包括：

（1）實(shí)驗(yàn)類型： 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量、相對定量（ΔΔCt）、基因分型等。

（2）樣品位置： 明確標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品、陰性對照（NTC）、陽性對照（PC）在板子上的位置。

（3）探針/染料設(shè)置： 確定每個(gè)孔使用的熒光染料通道（如FAM, VIC, ROX參比染料等）。

3、反應(yīng)體系配制（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）：

（1）根據(jù)試劑盒說明書或優(yōu)化后的方案，計(jì)算并配制主混合液。

（2）通常包括：SYBR Green qPCR預(yù)混液（或TaqMan探針預(yù)混液）、正反向引物、探針（如果使用）、無酶水。

（3）將主混合液分裝到PCR板或八連管中。

注意： 整個(gè)過程在冰上操作，避免酶失活。

二、賽默飛QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR第二部分：上機(jī)運(yùn)行

1、放置樣品板：

（1）打開QuantStudio 5的樣品槽門。

（2）注意板子方向： 將板子帶有A1角標(biāo)（左上角）的一側(cè)對準(zhǔn)樣品槽的對應(yīng)角落，平穩(wěn)放入。

（3）輕輕關(guān)上樣品槽門。

2、創(chuàng)建并設(shè)置新實(shí)驗(yàn)：

（1）在軟件主界面點(diǎn)擊 "New" 或 "創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)"。

（2）選擇實(shí)驗(yàn)類型： 如 Quantitation (定量) -> Standard Curve (標(biāo)準(zhǔn)曲線) 或 Quantitation - Comparative Ct (ΔΔCt)。

（3）選擇板子類型： 如96-well, 0.1 mL。

3、設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

（1）指定樣品： 在軟件界面的虛擬板圖上，用鼠標(biāo)選擇孔位，然后右鍵或從側(cè)邊欄設(shè)置其類型（Unknown, Standard, NTC等）和樣品名稱。

（2）指定探針/染料： 為每個(gè)孔分配檢測通道。例如，在 Detector 或 Assay 欄選擇或創(chuàng)建對應(yīng)的染料（如FAM-SYBR）。

（3）設(shè)置參比染料： 通常選擇ROX作為參比染料，用于校正孔間差異。

4、編輯反應(yīng)程序：

點(diǎn)擊 Protocol 選項(xiàng)卡，輸入以下典型的qPCR三步法程序：

（1）階段1：UNG酶消化（可選，防污染）

50°C，2分鐘

（2）階段2：熱啟動/預(yù)變性

95°C，2-10分鐘（根據(jù)預(yù)混液說明書）

（3）階段3：PCR循環(huán)（40-45個(gè)循環(huán)）

變性： 95°C，15秒

退火/延伸： 60°C，1分鐘 （在此步驟采集熒光信號）

（4）對于SYBR Green法，通常在退火/延伸結(jié)束時(shí)采集信號；對于TaqMan探針法，確保設(shè)置正確。

5、啟動運(yùn)行：

（1）檢查所有參數(shù)設(shè)置無誤后，點(diǎn)擊 "Start Run"。

（2）軟件會提示你輸入實(shí)驗(yàn)名稱、保存路徑等信息。

（3）確認(rèn)后，儀器將開始運(yùn)行。你可以聽到風(fēng)扇啟動和溫控模塊開始工作的聲音。

三、第三部分：運(yùn)行監(jiān)控與數(shù)據(jù)分析

1、實(shí)時(shí)監(jiān)控：

（1）在運(yùn)行過程中，軟件會實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增曲線、熒光信號圖等。

（2）檢查陰性對照（NTC）是否有擴(kuò)增，陽性對照和標(biāo)準(zhǔn)品曲線是否正常。

2、運(yùn)行結(jié)束：

（1）程序運(yùn)行完畢后，儀器會發(fā)出提示音。

（2）軟件會自動保存數(shù)據(jù)。

3、數(shù)據(jù)分析：

（1）在Analysis界面，軟件會根據(jù)你選擇的實(shí)驗(yàn)類型自動計(jì)算Ct值。

（2）對于標(biāo)準(zhǔn)曲線： 檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和R2值（理想斜率：-3.3， R2 > 0.99）。

（3）對于熔解曲線（SYBR Green）： 檢查產(chǎn)物特異性，單一峰表明擴(kuò)增特異。

（4）設(shè)置基線（Baseline）和閾值（Threshold），確保它們設(shè)置在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長期。

（5）導(dǎo)出數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。

四、第四部分：運(yùn)行后處理

1、取出樣品板：

（1）待儀器溫度降至安全范圍后（通常為4°C或室溫），打開樣品槽門，取出樣品板。

（2）注意： 板子和樣品可能含有擴(kuò)增產(chǎn)物，是潛在的污染源。請按照生物危害廢棄物處理規(guī)定進(jìn)行處理。

2、關(guān)機(jī)：

（1）通常情況下，儀器無需關(guān)閉電源，保持待機(jī)狀態(tài)即可。如果長期不用，可關(guān)閉儀器和電腦電源。

（2）填寫儀器使用記錄。

五、常見問題排查

1、信號弱或無信號： 檢查試劑是否失效、探針/引物設(shè)計(jì)是否合理、模板濃度是否過低、程序設(shè)置是否正確（特別是信號采集步驟）。

2、擴(kuò)增曲線異常： 檢查是否存在抑制劑、模板降解或加樣錯誤。

3、NTC出現(xiàn)擴(kuò)增： 表明存在污染，需檢查試劑、水、耗材或操作環(huán)境。

4、ROX信號報(bào)警： 檢查是否在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了ROX參比染料，但使用的預(yù)混液不含ROX，或反之。